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基因治疗
 

  基因导入细胞常用方法

  目的基因克隆的筛选与鉴定

  基因治疗的现状与前景

  基因治疗 Gene Therapy



  

  

  

 

 
   基因导入细胞常用方法

  
目的基因序列与载体连接后,要导入细胞中才能繁殖扩增,再经过筛选,才能获得重组DNA分子克隆,

不同的载体在不同的宿主细胞中繁殖,导入细胞的方法也不相同。

   一、转化


   由于外源DNA的进入而使细胞遗传性改变称为转化,早在1943年,Avery等就发现有毒肺炎双球菌的DNA与

无毒肺炎双球菌共培养后产生有毒性的肺炎双球菌后代的转化现象。但DNA进入细胞的效率很低,在分子生物学

和基因工程工作中可采取一些方法处理细胞,经处理后的细胞就容易接受外界DNA,称为感受态细胞,再与外源

DNA接触,就能提高转化效率。例如大肠杆菌经冰冷CaCl2的处理,就成为感受态细菌,当加入重组质粒并突然

由4℃转入42℃作短时间处理,质粒DNA就能进入细菌;用高电压脉冲短暂作用于细菌也能显著提高转化效率,这

称为电穿孔(electroporation)转化法

  二、感染


   噬菌体进入宿主细菌,病毒进入宿主细胞中繁殖就是感染(infection)。用经人工改造的噬菌体活病毒作

载体,以其DNA与目的序列重组后,在体外用噬菌体或病毒的外壳蛋白将重组DNA包装成有活力的噬菌体或病毒,

就能以感染的方式进入宿主细菌或细胞,使目的序列得以复制繁殖。感染的效率很高,但DNA包装成噬菌体或病

毒的操作较麻烦。 

  三、转染

  重组的噬菌体DNA也可象质粒DNA的方式进入宿主菌,即宿主菌先经过CaCl2,电穿孔等处理成感受态细菌再接

受DNA,进入感受态细菌的噬菌体DNA可以同样复制和繁殖,这种方式称为转染(transfection)。M13噬菌体DNA

导入大肠杆菌就常用转染的方法。重组DNA进入宿主细胞也常用转染方式。最经典的是1973年建立的磷酸钙法,其

利用的基本现象是:DNA如以磷酸钙-DNA共沉淀物形式出现时,培养细胞摄取DNA的效率会显著提高。用电穿孔法处

理培养的哺乳类细胞也能提高细胞摄取DNA能力,但所用外加电场的强度、电脉冲的长度等条件与处理细菌者都很

不相同。用人工脂质膜包裹DNA,形成的脂质体(Liposome)可以通过与细胞膜融合而将DNA导入细胞,方法简单而

有效,但缺点是有细胞毒性和血清的不亲和性,近年来人们发现了一种更为有效的转染试剂-阳离子聚合物,其克

服了脂质体转染试剂细胞毒性大,在体内易被血清清除等缺点,具有转染效率高,操作简单而日益受到重视。


 
 

 

 

 

 
 
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