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  RNA 干扰技术的原理与应用(下)

马鹏鹏 薛社普 韩代书 ( 中国医学科学院基础医学研究所 , 中国协和医科大学基础医学院细胞生物学系 , 北京 100005)

3.3 在翻译水平调节机体发育

对动植物中 RNAi 相关基因突变体的研究表明 RNAi 机制与生物发育过程相关 , 其作用机理是 RNAi 机制的某些组分通过与 PTGS 彼此分离但又密切相关的过程参与对发育过程的调控。 Ketting 等发现单个 Dicer 基因 dcr21 发生突变的线虫 , 除了 RNAi 机制缺失外 , 还产生了一系列表型改变。并且 dcr21 突变体表现出的发育时序的改变与 let27 和 lin24 突变体相似 , 而 let27 和 lin24 编码小分子 RNA , 在体内首先合成~ 70nt 长的 RNA 前体 , 然后在 Dicer 作用下生成~ 22nt 的小分子 RNA , 称为小分子瞬时 RNA ( small temporalRNA , stRNA) , 这些小 RNA 在线虫的发育过程中参与对 mRNA 翻译的调节 , 是特定基因的负调控因子 , 但并不介导 mRNA 的降解 , 而是结合于 mRNA3' 非翻译区 , 阻止核糖体与 mRNA 有效结合 , 从而抑制翻译的进行。 stRNA 和 siRNA 关系密切 , 除了都由 Dicer 加工成熟之外 , RNAi 必需的 Argonaute (alg21 , alg22) 家族基因也为两种 RNA 行使生物功能所必需。研究者认为在 RNAi 过程中形成的 RISC 复合物既含有 siRNA 又含有 stRNA , 此复合物可根据不同情况产生不同效应 , 它可利用 siRNA 与靶 mRNA 互补介导 mRNA 降解 , 但若 siRNA 与靶序列不能严格配对 ( 如有单个碱基错配 ) , 则 PTGS 即无法进行 , 此时复合物又可转而利用 stRNA 抑制核糖体在 mRNA 上延伸从而在翻译水平阻断基因表达 , 此模型中 RISC 作为一个平台 , 不同情况下可以募集不同的组件在其上装配 , 从而行使不同的功能 , 但最终均导致特定基因沉默 , 最近 Sharp 等证实在哺乳动物培养组织中 , siRNA 确实可通过与 mRNA3 ′端非翻译区结合而抑制翻译的进行。

3.4 作为基因组的免疫系统

所有的复杂生物的基因组在长期的进化过程中均面临着病毒等外来核酸序列的侵入 , 如人类基因组约有 54 % 的序列含有这种入侵留下的遗迹。那么生物怎样才能使自己的基因组免受外来核酸分子侵袭 , 保持结构完整呢 ? 研究表明 RNAi 机制在真核细胞中起着类似动物免疫系统的作用 , 充当基因组的防护者。在植物中 , RNAi 导致的 PTGS 和 VIGS 是保护基因组免受病毒入侵的重要机制 , 在动物中也存在类似的机制。除了可以抵御外来病毒入侵外 , RNAi 还可以控制基因组自身的寄生物 --- 转座因子的活动 , 在许多生物中 , RNAi 机制通过使转座因子或重复序列区域异染色质化 , 大大抑制了转座子和重复序列之间的同源重组对基因组可能造成的破坏。正是由于 RNAi 机制的存在 , 才使生物基因组在长期的进化过程中能够保持结构的完整性和遗传的连续性。综上所述 , 可见 RNAi 机制在真核生物生命活动中处于极为重要的地位 , 可以把它看作是一个以小分子 RNA 为核心的由多种组分构成的真核基因表达调控体系。它可以在转录水平、转录后水平和翻译水平调节基因表达 , 并与细胞众多生物学过程密切相关。

4 RNAi 技术的应用

虽然对 RNAi 的研究只有短短几年时间 , 但 RNAi 技术已经快速被应用于多个领域。

4.1 基因功能研究

随着人类基因组计划的提前完成 , 科学家急需一种新的、快速的方法解读基因的功能和基因的表达机制以及基因之间的相互关系。而 RNAi 技术已成为解决这些问题的重要手段。与其他方法相比 ,RNAi 技术在基因功能研究上有其独特的优点 : ①简单易行 , 容易开展 ; ②与基因敲除 ( geneknockout) 相比实验周期短 , 成本低 ; ③与反义技术相比具有高度特异性和高效性 ; ④可进行高通量 (high throughout) 基因功能分析。 RNAi 技术的诸多优点使它很快便被作为研究基因功能的主要方法 , 如 Harbth 等应用 RNAi 技术发现有 13 个基因对哺乳动物培养细胞的生长和分化必不可少。最近 Maeda 等利用高通量 RNAi 技术对线虫的大约 10000 多个基因进行了功能分析 , 取得了理想的效果。总之 , 随着后基因组学时代的到来 ,RNAi 技术将会成为功能基因组学研究的主要方法。

4.2 临床应用

前已述及 , RNAi 机制可作为真核生物的基因组免疫系统 , 抑制外源和内源有害基因的表达。人类目前对病毒 ( 如 HIV) 所致疾病缺乏理想的治疗方法 , 如果利用 RNAi 技术把与病毒基因具同源性的 siRNA 引入感染细胞将会抑制病毒的增殖 , 这为病毒相关疾病的治疗提供了新的思路 , 最近 Song 等利用 RNAi 技术在病毒性肝炎的治疗方面取得了很好的效果。另外 , 利用 RNAi 技术还可以高效、特异、快速的抑制细胞内癌基因的表达 , 人类的许多癌症是由于少数癌基因超表达导致细胞过度增殖所致 , 如果利用 RNAi 技术抑制过度表达的癌基因将会使癌症表型逆转或病程得以控制。 Yin 等利用人类皮肤癌细胞作为模型 , 将一组与癌基因具同源性的 siRNA 引入人黑素瘤细胞 , 结果发现癌细胞的异常增殖被显著抑制。最近 Brummelkamp 等开发的一种质粒系统 (pSUPER) 可以使 siRNA 在哺乳动物细胞内长时间稳定表达 , 这为抗癌药物开发和应用开辟了新的途径。可以预测 , RNAi 技术将会很快应用于癌症和病毒疾病的治疗 , 并可能会为这些疾病治疗带来突破。

5 RNAi 技术要点

5.1 siRNA 的设计

以前人们一般应用较长的 dsRNA 作为基因沉默的工具 , 但后来发现长链 dsRNA 特异性较差。它可激活 RNaseL 导致非特异性 RNA 降解 , 还能激活依赖于 dsRNA 的蛋白激酶 R (protein kinaseR , PKR) , PKR 可磷酸化翻译起始因子 e IF2a 并使其失活 , 从而抑制翻译起始。后来人们发现小于 30bp 的 dsRNA 就可以有效引起基因沉默 , 并且不会产生非特异抑制现象 , 进一步研究表明抑制作用最强的是长 21bp 、 3' 端有两个碱基突出的 siRNA 。但 RNAi 技术要求 siRNA 反义链与靶基因序列之间严格的碱基配对 , 单个碱基错配就会大大降低沉默效应 , 而且 siRNA 还可以造成与其具同源性的其它基因沉默 ( 也叫交叉沉默 ) , 所以在 siRNA 的设计中序列问题是至关重要的。要求所设计的 siRNA 只能与靶基因具高度同源性而尽可能少的与其他基因同源。设计 siRNA 序列应注意以下几点 : ①从靶基因转录本起始密码子 AU G 开始 , 向下游寻找 AA 双核苷酸序列 , 将此双核苷酸序列和其下游相邻 19 个核苷酸作为 siRNA 序列设计模板 ; ②每个基因选择 4 ~ 5 个 siRNA 序列 , 然后运用生物信息学方法进行同源性比较 , 剔除与其他基因有同源性的序列 , 选出一个特异性最强的 siRNA; ③尽量不要以 mRNA 的 5' 端和 3' 端非翻译区及起始密码子附近序列作为设计 siRNA 的模板 , 因为这些区域有许多调节蛋白结合位点 ( 如翻译起始复合物 ) , 调节蛋白会与 RISC 竞争结合靶序列 , 降低 siRNA 的基因沉默效应。

5.2 siRNA 的合成

目前获得 siRNA 主要有三种方法 , 化学合成、体外酶法合成和体内转录。

5.2.1 化学合成

siRNA 可以直接进行化学合成 , 方便且不受碱基限制 , 但合成一个 siRNA 需先分别合成两条单链 ( 每条链合成需 20 步反应 , 每步反应产物均需纯化 ) , 然后再退火成双链 RNA , 合成耗时长且费用很高。

5.2.2 体外酶法合成

与化学合成相比体外酶法合成要经济得多 , 此法需首先合成两段 29nt 的 DNA , 包括 8 个与 T7 启动子 3' 端互补的碱基 ( 称为引导序列 , leadersequence) 和由 21 个碱基构成的 siRNA 编码序列。将这两段 DNA 分别和 T7 启动子混合 , T7 启动子和 DNA 引导序列退火结合 , 然后用 DNA 聚合酶 Klenow 大片断补齐成为可用于转录的双链 DNA 模板 , 分别用 T7 RNA 聚合酶进行体外转录 , 再将产物混合形成 dsRNA 。新的双链 RNA 包含 5' 端单链的引导序列和中间互补的 19 个碱基序列以及 3' 端两个重复的 U (UU) , 以 DNA 酶降解模板 , 同时用单链专一的核糖核酸酶 (RNase) 消化 5' 的引导序列 , 由于 RNase 不能切开 U 碱基也不能降解双链 RNA , 所以得到的产物就是所需的 21bp 的双链 siRNA --- 有 19 对碱基互补 , 3' 端各有 2 个 U 突出。用酶法合成的 siRNA 比化学合成的同序列 siRNA 活性高 20 倍 , 估计可能是由于 siRNA 纯度的差异造成的结果。

5.2.3 体内转录

最近有几个研究小组构建了一些可以在真核细胞内表达 siRNA 的载体 , 包括被广泛应用的质粒载体和新研发的转染效率较高的病毒载体。质粒载体都包含有一个 RNA 聚合酶Ⅲ ( Pol Ⅲ ) 启动子和一个 4 ~ 5 个连续的 T 构成的转录终止位点以及选择标记 , 选用 Pol Ⅲ启动子是因为此启动子总是在距其一定距离的位置起始转录 , 而遇到 4 ~ 5 个连续的 T 就终止转录 , 并且终止于转录终止位点第二个碱基处 , 十分精确。此法需首先化学合成一段编码 siRNA 正义和反义链的模板 , 正义与反义序列之间由一段环 (loop) 序列隔开 ( 图 2A) , 插入载体 Pol Ⅲ启动子下游 , 然后转入细胞 , 环序列可使转录出的 RNA 链折叠成具发夹结构的小 RNA 分子 ( 图 2C) , 这些小 RNA 可被细胞内的 Dicer 切割为长 21bp 的 siRNA --- 有 19 对互补碱基 , 3' 端各有 2 个 U 突出 , 可引起特定基因沉默。与化学合成及体外酶法合成相比 , 表达载体是在细胞内通过转录持续产生 siRNA , 所以可延长 siRNA 作用时间 , 目前此法已被广泛应用。

 

 
   
 

5.3 siRNA 导入细胞的方法

在体外 (in vit ro) 可用不同的方法将 siRNA 导入靶细胞 , 一般来讲化学合成和体外酶法合成的 siRNA 可用电转移 (elect roporation) 、微注射和转染的方法引入细胞。而表达质粒则常通过转染的方法导入靶细胞然后再表达 siRNA 。向体内 (in vivo) 导入 siRNA 的研究工作也已有报道 , 如有研究者用静脉注射的方法将合成的 siRNA 引入动物体内进行基因功能的研究。但这些方法所产生的抑制效应都是很短暂的 , 一般有效期只有一周左右。最近 Abbas 等利用改造后的病毒载体转染哺乳动物细胞 , 发现在细胞内的抑制效应可持续 25 天左右 , 进一步促进了 RNAi 技术的应用。

6. 结语

虽然人们对 RNAi 的研究只有短短的几年时间 , 但进展却极为迅速。这种奇特的生物学现象使人们不得不对 RNA 在生命活动中的作用进行重新认识。可以认为 RNAi 是一个以小分子 RNA 为中心的真核细胞基因表达调控系统 , 它可以在多个层面调节基因表达和细胞的增殖分化 , 通过对 RNAi 的研究将会使人们对生命现象的认识更加深入。同时 , RNAi 技术为人们更迅速、更准确的剖析基因的功能 , 分析基因之间错综复杂的联系和相互作用提供了极为有用的工具。而且它还为人们预防和治疗癌症和病毒疾病提供了新的思路 , RNAi 技术必将为生命科学研究和临床治疗带来新的革命。

 

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